Токсикология на марше

   Я пока работаю на химическом предприятии, и по долгу службы мне приходится заниматься токсикологическими аспектами, а также консультировать по ним работников других отделов. Не могу сказать, что эта часть моей многогранной деятельности является любимой, но иногда встречается и в этой работе что-то интересное.
   Как только я начинал знакомиться с подходами к токсикологической оценке веществ и материалов, то пришёл к 2 выводам: при полной монополии государства (по крайней мере, в Беларуси) на определение подходов к токсикологическому нормированию в этой области царит полная неразбериха и отсутствие всякой логики.
   Я неоднократно писал в блоге о своих столкновениях с санитарно-эпидемиологической службой, но, как вы сами понимаете, это даже меньше, чем верхушка айсберга: бесчисленное количество писем (так и не отвеченных) осталось за кадром (передаю пламенные приведы ГУ «Республиканский центр гугуены, эпидемиологии и, будь оно неладно, общественного здоровья»).
   Была среди моих читателей санитарный врач, но и та свалила в Америку и не пишет, а так хотелось спросить: какой, б..дь, логике учат вас при определении допустимых уровней токсикологической опасности веществ?
   Но оставим нецензурщину. Поговорим о том, как поступают в цивилизованных Европах, где существует практика постоянного пересмотра токсикологического досье тех или иных веществ и практика публичных унижений обсуждений сего действа.
   
   Есть такое вещество – о-бензил-п-хлорфенол, или хлорофен. Используется в качестве антимикробного агента в разных отраслях промышленности. В Европах производится фирмой Lanxess.
   После очередного раунда испытаний и некого предварительного решения по поводу основных разновидностей его токсичности (для репродуктивной системы, сенсибилизирующего действия, канцерогенности, острой и хронической токсичности и т.п.) состоялось обсуждение, в ходе которого та или иная сторона (страна) выражала своё согласие и/или несогласие с этой предварительной оценкой.
   Я приведу ответы фирмы производителя. Понятное дело, он, как никто другой, заинтересован в признании вещества как можно менее опасным, чтобы можно было делать на нём бабло. Но лишь глубокое понимание принципов токсикологического тестирования позволяет апеллировать при наличии на первый взгляд очевидных доказательств опасности этого, надо сказать, достаточно неприятного в обращении вещества. Королева в восхищении! Мы в восхищении!

   Сенсибилизирующее действие.
   В зависимости от того, в какой дозе и у какого количества пробантов (испытуемых) вещество вызывает аллергию, все потенциальные сенсибилизаторы согласно европейским директивам делятся на 2 категории: 1 А и 1 В. Вещества категории 1 А являются более сильными аллергенами, т.е. склонны вызывать реакции у большей доли пробантов при меньшей концентрации.
   Первоначально хлорофену была присвоена категория Skin. Sens. 1А.
   Lanxess, естественно, настаивает на присвоении хлорофену классификации Skin. Sens. 1В, аргументируя это следующим.
   1. Проведённые исследования (у 19 из 20 животных развился очень тяжёлый аллергический дерматит), а именно, тест Бюлера, который послужил основанием для присвоения категории Skin. Sens. 1А, были выполнены с ошибками.
   Дело в том, что подобные тесту Бюлера тесты in vivo проводятся в 2 этапа. На первом этапе проводят индукцию, т.е. первичную аппликацию вещества, а на втором – провокационную пробу, т.е. наносят то же вещество после перерыва на ту же самую поверхность кожи. У теста есть 2 особенности:
1) вещество должно наноситься на кожу в максимальной концентрации, вызывающей минимальное раздражения;
2) в фазе индукции и провокации вещество должно наноситься на один и тот же участок кожи.
   В ключевом исследовании были нарушены оба требования. Вещество на этапе индукции вызывало столь сильное раздражение (вплоть до изъязвления), что провокационную пробу приходилось ставить на новом участке кожи.
   2. Фирма нашла корректно проведённые исследования (также тесты Бюлера), в которых хлорофен вызывал аллергические реакции у сравнительно небольшого количества животных, что позволяет присвоить ему квалификацию Skin. Sens. 1В, а не 1А.
   3. Существует статистика аллергических реакций на хлорофен у людей. Как оказалось, жалобы на аллергию на это вещество подтверждаются путём постановки соответствующих кожных проб у сравнительно небольшого количества пациентов (хотя, честно сказать, картинки порой попадаются занятные).

   Влияние на репродуктивное здоровье.
   При изучении влияния на репродуктивное здоровье ставят цель определить наличие у вещества способности препятствовать зачатию, нарушать вынашивание потомства, а также вызывать антенатальную (внутриутробную) гибель плода и различные его уродства.
   Как вы понимаете, вред репродуктивному здоровью – весьма существенный критерий, который сильно ограничивает сферу применения того или иного вещества. Наличие той же сенсибилизирующей способности является менее серьёзным фактором риска, поэтому желание компании-производителя избавиться от ярлыка «репродуктивный токсикант» для своей продукции весьма понятно.
   Изучение репродуктивной токсичности выполняют на самках и самцах лабораторных животных двух поколений. Оценивают отклонения в брачном поведении, половые циклы, качество и количество половых клеток, изменения в половых органах, успешность зачатия, течение беременности, число приплода и его здоровье.
   В основу доказательной базы для неприятного критерия Repro Cat 2 для хлорофена, означающего вероятную репродуктивную токсичность (не самая высокая категория, надо сказать), было положено исследование, в котором при приеме вещества в дозе 540 мг/кг/день индекс фертильности самок понизился до 76,7 % (при минимальном значении 88 % в историческом контроле).
   Однако Lanxess с упорством, достойным подражания и похвал, отстаивает точку зрения, заключающуюся в том, что о-бензил-п-хлорфенол не влияет на репродукцию. И вот каким образом фирма аргументирует невиновность своей продукции.
   Во-первых, вещество не уменьшало коэффициент фертильности самцов, даже наоборот: оно его увеличивало до 100 %.
   Несмотря на то, что самки, которым во время беременности давали 540 мг/кг/день токсиканта, потребляли гораздо больше корма, их вес по сравнению с весом контрольных животных не увеличивался, а уменьшался. Учитывая, что хлорофен не влиял на число и вес потомства, можно сделать вывод о том, что уменьшение индекса фертильности связано не со специфическим действием, а с токсичностью вещества по отношению к материнскому организму. Проще говоря, самки не беременели потому, что их организм был ослаблен, а не потому, что хлорофен непосредственно вмешивался в процесс зачатия.
   Токсическое действие хлорофена на организм самок выражалось не только в уменьшении их массы тела, но в увеличении массы почек и печени – органов, участвовавших в выведении токсиканта из организма.
   В доказательство отсутствия у хлорофена репродуктивной токсичности фирмой Lanxess также были приведены результаты других, не таких масштабных исследований, которые, тем не менее, демонстрировали отсутствие каких-либо признаков токсического воздействия на эмбрионы и на половую систему родительских особей.

   Хроническая токсичность
   При изучении хронической токсичности веществ особое внимание уделяют поиску так называемых органов-мишеней, т.е. органов, которые поражаются токсикантом специфически. Если такое поражение существует, то изучаемому веществу в зависимости от дозы и числа поражённых пробантов присваивают категорию STOT RE 1 (более токсичные) или STOT RE 2 (менее токсичные). Первоначально хлорофену, как можно догадаться, была присвоена категория STOT RE 1. Lanxess, естественно, сопротивлялся и хотел понизить класс опасности до STOT RE 2.
   Фирма не отрицает того факта, что о-бензил-п-хлорфенол токсичен для почек. Однако тщательный анализ проведённых исследований может свидетельствовать о том, что минимальная токсичная доза была завышена.
   К примеру, вывод о пороговой дозе воздействия в одном из исследований был сделан на основе наблюдения об увеличении относительной массы почек у самцов собак породы бигль. Но эксперты Lanxess отмечают, что абсолютная масса органа при введении токсиканта в этой дозе не увеличилась.
   Фирма приводит ссылка на исследования, в которых порог токсического действия хлорофена позволяет вообще не классифицировать это вещество как обладающее значимой хронической токсичностью.
   Любопытна аргументация Lanxess по поводу достаточно древнего исследования на новозеландских кроликах 1985 года, в которых вещество вводилось перкутанно, т.н. накожно.
   Несмотря на явные гистологические признаки нефротоксичности в опыте, подобные результаты были получены и в контроле. Сами же показали диуреза и биохимический состав крови (при дозе, соответствующей STOT RE 2) под действием токсиканта не изменялись, т.е. функция органов выделения нарушена на была.

   Канцерогенность.
   Ещё один пугающий для любого производителя ярлык – канцерогенность. Первоначально хлорофену планировалось присвоить категорию Carc Cat 2, означающую, что вещество может являться канцерогеном для человека.
   Исследования по выявлению канцерогенности являются хроническим, т.е. весьма длительным. Их также проводят на самцах и самках, в силу разной чувствительности особей женского и мужского пола к канцерогенам.
   Одно из таких исследований, проведённое на крысах, показало, что у самцов не происходит статистически значимого, по сравнению с контролем, увеличения частоты возникновения опухолей под действием хлорофена.
   У самок, которые в силу меньшей чувствительности получали большие дозы токсиканта, в нескольких опытных группах (по 1 из 60) развилась редкая опухоль почек – переходно-клеточный почечный рак.
   Поскольку проводившие тестирование исследователи не смогли найти сообщения об этом типе рака в исторических контролях (данные по 1000 крысам), то сделали вывод о возможном канцерогенном действии хлорофена, что привело к присвоению категории Carc Cat 2 по этому признаку.
   Однако дотошные (и, видимо, высокооплачиваемые) токсикологи Lanxess смогли выискать появление этого типа рака в исторических контролях: 3 случая на 3000 крыс у самок и 2 случая на 3000 крыс у самцов. Тем самым они опровергают редкость данной формы рака и, следовательно, статистическую значимость его находок в опытных группах.
   Lanxess приводит исследования, доказывающие отсутствие мутагенности у хлорофена и далее продолжает свою аргументацию, рассматривая причины канцерогенности немутагенов.
   Немутагены могут способствовать канцерогенезу, вызывая гиперплазию, т.е. избыточное разрастание, обычной ткани. Насколько я могу судить, вероятность образования опухолевых клеток при этом повышается за счёт статистического фактора. Если и для каждой клетки она не изменяется, то рост её происходит за счёт увеличения числа самих клеток.
   Действительно, гиперплазия почечной ткани существенно повышается под действием о-бензил-п-хлорфенола. Тем не менее, связать её с канцерогенезом, по мнению Lanxess, нельзя, так как в группах самцов процент гиперплазии больше, а случаев опухолевого перерождения нет, оба случая переходно-клеточного рака отмечены у самок (см. выше).
   Производитель обсуждает ещё одно хроническое исследование по выявлению канцерогенности хлорофена, на сей раз на мышах.
   В этом исследовании ситуация несколько обратная. У самок рак не развивался, в том время как у самцов была статистически значимо повышена частота аденом (доброкачественных опухолей) и были находки нескольких карцином (рака) почек, однако последние не были статистически значимыми.
   Поскольку хлорофен проявлял при вводимых дозах (от 120 мг/кг/день) заметную системную токсичность, то животные опытных групп очень сильно теряли в весе по сравнению с контролем. А протокол исследования определяет, что оно имеет силу в том случае, если вес животных в опыте отличается от веса животных в контроле не более чем на 10 %, что ставит полученные данные под сомнения.
   Таким образом, по мнению производителя, случаи аденом свидетельствуют не о канцерогенности, а о нефротоксичности хлорофена.
   Существуют разновидности исследований, которые позволяют выявить наличие у испытуемого вещества способности быть инициатором, промотором канцерогенеза, а также так называемым полным канцерогеном, т.е. веществом, сочетающим свойства первых двух. Такие исследования часто проводят при накожном нанесении субстанции, причём они описаны для хлорофена.
   Полученные данные на первый взгляд позволяют причислить хлорофен к слабым опухолевым промоторам, так как его многократные кожные аппликации (в самой высокой дозе) приводили в определённых условиях к увеличению частоты папиллом. Однако, как отмечают специалисты Lanxess, указанная доза является раздражающей (в дозах, не вызывающих раздражения хлорофен не проявил себя как промотор канцерогенеза). Таким образом, повышенная частота папиллом скорее объясняется не канцерогенными свойствами, а связана с кожной реакцией, а именно с усилением деления клеток кожи в ответ на раздражающее действие токсиканта (регенеративная пролиферация).
   Короче, всем учиться у Lanxess.
   Чмоке, ваш superhimik
   P.S. Наткнулся на итоговый документ уже после того, как написал пост. Там ответы на замечания. Очень советую почитать: http://echa.europa.eu/documents/10162/831dbc20-0c3d-40cf-9812-17bab5593597.
   P.P.S. Итоговый документ: http://echa.europa.eu/documents/10162/d4cc5d96-7f84-4e10-9280-1fcee8db2e59. Что удалось отстоять фирме, полюбопытствуйте сами в качестве домашнего задания :-).