В попередніх серіях ми пробіглись галопом по ДНК і РНК. На черзі - . білОчки.
На білковому рівні розгортається справжнє різноманіття. Білки віртуально задіяні у всіх біологічних процесах. Вони складають 50% сухої ваги організму. В живій клітині може нараховувати до 1 млн різних білків (хоч генів, з яких вони зчитуються, набагато менше). Вони мають різну третинну і четвертинну структуру, хімічно модифікуються, утворюють комплекси і відіграють різну біологічну роль. Білки мають також різні фізико-хімічні властивості, тому виділення одним махом всіх білків в нативному стані неможливо.
Втім і в цій галузі робляться постійні спроби взяти нахрапом і проаналізувати якомого більше білків одночасно.
Тут зараз буде переважно огляд методів, яких значно більше і вони набагато складніші, ніж проста прочитка ДНК, або РНК, але тим не менше, в кожному конкретному випадку буде посил для біоінформатиків, де вони треба.
Для затравки розкажу спочатку про виключно біоінформатичні методи трансляції і аналізу білків.
Отже, у нас є послідовність РНК. Якщо ми знайдемо старт ATG і будем від нього читати кожен триплет і перекладати його у відповідну амінокислоту, ми отримаємо первинну послідовність білка. Такі транслятори вбудовані у всі робочі програми, що аналізують генні послідовності.
Тепер цю амінокислотну послідовність також можна записати в FAST file, порівнювати між собою (alighnment) або шукати в базах даних подібні (той самий BLAST алгоритм) і кластеризувати (Clustal) , досліджуючи філогенію, або спорідненість. Тут підходи і інструменти дуже подібні до аналіду ДНК послідовностей.
Також цій послідовності можна шукати вже якісь фічі - як то місця розрізу іншими білками, або місця хімічної модифікації, або передбачати сигнальні якісь послідовності. Софти для цього діла є тут.
Потім можна перейти до передбачення вторинної і третинної структури. До речі, щось подібне робили в інституті харчовоїї біотехнології і геноміки, а саме моделювання тубулінів, просто діставши їх послідовності з баз даних і прогнавши через софтину (дивитись методи Microtubule protofilament modeling). Не те, щоб це вже буде дуже замудра робота, але досі подібного систематичного моделювання саме цього білка таким чином не робили. А таких, як я вже казала, мільйони.
Перейдем до експериментальної роботи.
В той час, коли для виділення ДНК достатньо плюнути або розтерти, а для виділення РНК те саме, тільки попередньо помивши руки, виділення білків і їх аналітика це високе мистецтво. Білковики це така біохімічна еліта, яка може дати фору цитологам - які взагалі бачать в мікроскоп щось своє.
2Д-електрофорез.
Виділяють білки фракціонуючи (тут все складно, має значення все - кислотність, температура, солі, органічні розчинники, детергенти) і розганяють їх в електричному полі в акриламідному гелі. Є купа різних варіантів, найпростіший принцип такий. Десь побачила в книжці смішний приклад. У нас є мішана група людей: сто товстяків, сто нормальних дорослих і сто дітлахів. Аби їх розділити, запропонували бігти по густому чагарнику. Дітлахи вириваються вперед, потім дорослі прориваються, а товстуни застряють десь в хащах. Таким чином ми розділили ці групи.
Але в кожній з цих груп є також різні за прудкістю особини. Тому тепер ми розвертаємо їх на 90° і пропонуємо побігти ще трошки. Дітлахи розділяються по прудкості, дорослі також, декому з товстунів також вдалось пробратись далі. З білками роблять так само, при цьому примушують бігти в гелі під струмом. Спочатку ділять в градієнті кислотності по власному заряду білка, а потім дентурують детергентом так, що вони всі стають негативно-заряджені і розділяються по масі.
Виглядає на схемі ось так.
А в житті ось так.
Тепер ці туманності треба проаналізувати, беручи до уваги, що ми поняття не маєм, що це за білки. Отже, спочатку проводиться просте порівняння іміджів знову ж так, пацієнт - здорова людина, або трансгенний горох і горох нормальний.
Софт для цього є, але переважно комерційний. Наприклад Melanie, Delta2D, Dymension.
Після чого всі детектовані споти нормалізуються, сортуються по достовірності, інтенсивності і так далі.
Щоб дізнатись, що це за білки, тепер треба їх звідти виколупати. Роблять це вручну або роботом spot cutter. Робот облаштований власним софтом для spot detection.
Після цього виколупані білки очищають від гелю, фарбника і ріжуть в хлам іншим білком, трипсином і відправляють на масс-спектрометрію.
В принципі можна просто виділити сумарний білок без цих плясок з електрофорезом, порізати в хлам і відправити на масс-спектрометрію, перед цим гарненько розділивши за допомогою High performance liquid chromatography (HPLC) .
Масс-спектрометрія.
Є купа різних варіацій: з основних matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) або electrospray ionization time-of-flight (ESI-TOF), які відрізняються тільки способом іонізації. Трошки поглиблений варіант tandem mass spectrometry (MS/MS) на основі того ж MALDI-TOF або ESI-TOF. Крім того щ є fourier-transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometry, quadrupole mass analyzer та ще декілька інших.
Не відволікайтесь від екранів, бо спектрометрія знадобиться нам ще на метаболоміці. Це тільки звучить страшно, насправді це не дуже складно.
Порізаний на короткі шматки білок іонізується різними способами і розганяється в магнітному полі в вакуумі. Оскільки молекули тепер всі позитивно заряджені, то розділяються вони по вазі. Рахують співвідношення ваги до заряду (m/z) і на виході получається спектр або окремих пептидів, або амінокислот, або окремих молекул.
Ось, наприклад, MALDI-TOF MS.
Як би там не було, на виході у нас спектри.
Тепер прийшов час біоінформатиків. По-перше, є купа баз даних по індентифікації спектрів. Основні з них
Mascot.
Але є потужні софти, які перелінковані до різних баз даних і можуть пропонувати результати під ключ.
Один з найпростіших вступів в протеоміку тут.
Всі дані експериментів протеоміки складаються в бази даних. Наприклад сюди або сюди.
Їх так само аналізують різними інструментами для встановлення каскадів передачі сигналу, ензиматичних нетворків і так далі.
Крім цих великих підходів протеоміки, є це купа дрібніших, які розроблені для вирішення локальних біологічних завдань. Що нам дають знання про білки?
Білки можуть бути біомаркерами і вказувати на захворювання - це може бути діагностична роль. Деяки білки самі по собі можуть причиною захворювання - наприклад, хибне складування білка призводить до розвитку Альцгеймера. І нарешті, з білками ми ступаємо на дуже складну ниву і там ще білих плям значно більше, ніж на ДНК.
Але це все ще не настільки складно, як метаболоміка. Білки - це один клас, хоч і дуже різноманітних за якостями, сполук. Метаболітів, хоч і менше, ніж білків, вони набагато різноманітніші по властивостям.
Ні, сьогодні вже не встигну, у нас тут до того всього ще й евалюація інституту. Метаболоміка і феноміка, а також комбінація всього в купу наступним разом.
Комментарии (0)