Другие новости от imbg.livejournal.com
Реклама на проекте
Задача по биологии
Tuesday, 14 July, 04:07,
imbg.livejournal.com
Предистория: на сегодня CRISPR довольно удобный инструмент делать клеточные линии с нокаутами. Обычно готовят вирус, где есть Cas9, giRNA, и маркер для селекции. Минус этой системы - громоздкость плазмиды, что делает сложным частое клонирования. когда мы хотим выключить этот и этот и эти гены, а после обеда придумаем что еще те два тоже надо. То же самое с маркерами селекции - их у эукариотов довольно мало, пальцев руки хватит чтоб перечислить. Нам же надо, чтоб одну и ту же клетку можно было нокаутировать последовательно много раз.
Первый подход: несколько самых популярных клеточных линий (HeLa etc) инфицировали вирусом с Cas9 под пуромициновой устойчивостью. Когда отобрали нужные клоны, их транзиентно трансфецируем требуемыми giRNA. Все работает, но проблема с отбором клонов - нокаутные клетки смешиваются с теми, где фича не сработала. Рассеивание клеток по 1 штуке на квадратный метр и прочие крестьянские приемы отбора клонов не подходят - во-первых, слишком много времени и сил для рутины; во-вторых нокауты все равно чисто не разделяются.
Второй подход: при трансфекции giRNA добавляем к ним флуоресцентную метку. После трансфекции позитичные клетки отбираем FACS'ом. Почти сработало, но все таки не чисто - попадение флуорофора внутрь не гарантирует нокаута, и в итого мы опять получаем смесь позитивных и негативных клеток. Плюс - после сортинга клетки чувствуют себя уставшими, и при делении на мелкие группы для формирования клоном имеют склонность к самоубийству. Промучались пару месяцев с настройками системы, но вряд ли она будет признанной подходящей для наших целей.
Вот на этом этапе мы думаем - какой бы позитивный маркер для срабатывания CRISPR установить, чтоб отбор позитивных клонов стал простой рутиной, доступной для средней руки лаборанта - потому как нам некогда больше с этим всем возится, нам тайны природы постигать надо. Что важно - метаболизм клетки не менять - т.е. активировать секрецию поверхностных маркеров типа CD4 на Hela не может быть признанным как подходящий способ - поди потом докажи что ты не изменил метаболизм до неузнаваемости...
Буду благодарен за любые фантазии.
Комментарии (0)